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原代细胞的制作

发布时间:2019-08-01 阅读:117

材料:

PBS溶液,0.9%生理盐水, DMEM,

器材:

剪刀,烧杯,保温瓶,

 

原代细胞的取材 

一、取材的基本要求

(1)取材要注意新鲜和保鲜  新鲜组织易于培养成功,取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞,尽快入箱培养,若不能即时培养,应将组织浸泡于培养液内,于4℃存放。若组织块较大,应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后,切碎于培养液内4℃存放,但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基,按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。

(2)取材应严格无菌  所取标本材料应在无菌条件下进行,为了确保无菌,对所取材料若疑有污染的可能,应将所取组织在含高浓度抗菌素(400单位/mL)甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上,再用PBS洗2~3次,以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液(内含400单位/mL抗菌素)的小瓶等便于携带的物品来取材,所取材料应避免接触有毒有害的化学物质,如碘、汞等。

3)取材和原代细胞制作时,要用锋利的器械,如手术刀或剃须刀片切碎组织,尽可能减少对细胞的机械损伤。

4)要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织,切碎组织时应避免组织干燥,可在含少量培养液的器皿中进行。

5)取材应注意组织类型、分化程度、年龄等,一般来讲,胚胎组织较成熟个体组织容易培养,分化低的较分化高的组织容易生长,肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。

6)原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录,以备以后查询。

 

原代细胞的分离和制作 

人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,即使采用1mm3的组织块,也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长,若需获取大量细胞,必须将现有的组织块充分散开,使细胞解离出来,常采用的方法如下:

一、悬浮细胞的分离方法

 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料,Z简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟,若悬液量大,可适当延长离心时间,但速度不能太高,延时也不能太长,以避免挤压或机械损伤细胞,离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次,用培养基洗一次后,调整适当细胞浓度后再分瓶培养,若选用悬液中某些细胞,常采用离心后的细胞分层液,因为,经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层,这样可根据需要收获目的细胞 .

二、实体组织材料的分离方法

(一)机械分散法

  所取材料若纤维成分很少,如脑组织,部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分

散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头

压出,或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此

法分离细胞虽然简便、快速,但对组织机械损伤大,而且细胞分散效果差。此法仅适

用于处理纤维成分少的软组织。

(二)消化分离法

1、酶消化分离法

酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶,其分离方法如下:

(1)胰蛋白酶分散技术  

    胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开.胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。

①细胞类型  胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如  乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效.

②酶的浓度  胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250).

分离方法如下:

①过夜冷消化  将取得的组织用Hanks液洗三次,剪成碎块大小为4毫米左右,用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织,再加入0.25%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃过夜,次日再用Hanks液洗涤,弃去上清,共洗2~3次,然后,加入少量营养液吹打分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。

(2)胶原酶(Collagenase)消化法

适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用.可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,Z终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL。

2、非酶消化法(EDTA消化法)

 常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液,对一些组织,尤其是上皮组织分散. 

消化分离法的操作步骤:

1)剪切  把组织块剪碎,呈1~5mm3大小的组织块。

(2)加液漂洗  将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2-3次(采用倾斜,自然沉降法)。

3)消化  加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。

4)弃去消化液  采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。

5)漂洗  将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入,中止消化反应,采用漂洗法洗2-3次后,加入完全培养基。

6)机械分散  采用吸管吹打或振荡法,使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养,若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟,吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

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