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细胞计数方法

发布时间:2019-08-14 阅读:175

细胞计数方法

细胞计数

实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作:

.准备工作:    

    取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用。

.细胞悬液制备:

细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。

.细胞计数:

1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

   2.制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

   3.将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。

   4.统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。

   5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度:


(细胞悬液的细胞数)/ml          (  四个大格子细胞数/4)         ×2×104 

说明:公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以2因为细胞悬液于染液是11稀释。


公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:

1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3  1ml1000mm3

.细胞计数要点:

   1.进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;

   2.要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。

   3.取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;

   4. 数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。

   5. 操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。

.初学者易犯的错误:

   1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。

   2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

   3. 滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。

.本实验特殊试剂的配制:

4%台盼蓝母液:称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。

使用液:使用时,用PBS稀释母液至0.4%即可。

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