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PCR试剂盒之“核酸制备”与“扩增试剂”

发布时间:2019-11-01 阅读:78

    常言道“巧妇难为无米之炊”,但又云“有什么样的米、做什么样的饭”,也就是说,物品的先天属性很重要,就像专业的事应由专业的人来做一样,否则就难以收获满意的效果!就临床荧光PCR检测质量而言,“试剂盒的品质、操作人员的专业素质和仪器性能”,堪称实验室质量建设的三支点。其中,试剂盒的品质zui为重要。

    PCR试剂盒包含“核酸制备”和“扩增试剂”两个组分。近年出现了一类备案的核酸提取试剂盒与三类体外诊断试剂盒的“婚配”,其合理性值得商榷。传统观念认为,评价PCR试剂盒的优劣,只看扩增试剂,其实不然,核酸制备的质量直接决定PCR扩增成败,如RNA的纯化,其完整性和得率与逆转录效率和扩增效率直接相关。目前PCR试剂盒配伍的核酸提取方法种类较多,但关键点各有不同,操作人员只有对试剂盒进行充分的了解和科学操作,或许能重现说明书声称的性能。扩增试剂部分主要由扩增反应液和酶组成,的确是PCR试剂盒非常关键的部分。其实,不同厂家或时代的试剂盒质量差异巨大,我们用不同厂家的扩增试剂去扩增同一纯化核酸,得出的扩增效率和结果重复性完全不同。知己知彼,方能百战不殆,下面就不同核酸提取方法及特点进行分析,希望对提高实验室的检测质量有帮助。检验医学网

    一、核酸提取方法对检测质量的影响

    1、煮沸法:试剂盒一般采用20%聚乙二醇6000(PEG)进行样本核酸沉淀(或富集),去除上清液后,加入碱性裂解液煮沸,离心析出的上清液即作为PCR扩增的模板。这种方法的优点是操作简单。但有以下不足:

    1)由于PEG沉淀物非常粘稠,裂解液较难彻底与之均匀混合,其混匀程度明显影响核酸的释放量,影响检测的重复性;

    2)核酸纯度低,干扰蛋白多,是试剂盒稳定性和敏感性差的主要原因;

    3)高温煮沸的核酸释放方式,大大增加实验室气溶胶污染的机会;

    4)核酸废液难以封闭收集,防污染工作难度大,严重影响低拷贝样本的准确定量。由于以上不足,目前试剂盒已少有使用。

    2、微量核酸释放剂:核酸释放剂主要由碱性液体组成,与微量血清或血浆样本混匀实现核酸的简单裂解,PCR扩增反应液直接加入混合液中扩增。优点是操作简单。但有以下不足:

    1)稳定性差:原因之一是,核酸释放剂与扩增试剂为一对中合体,核酸释放剂加入量的准确度直接影响扩增反应液的pH值或改变扩增试剂的组分;其次,微量操作是个技术活!精准操作的要求在普通实验人员较难达到!这是直接被忽视的问题。如果把实验室工作人员组织起来进行微量操作考核,结果你就会发现,能够胜任的操作人员并不多!正因为操作“太简单”、所以很容易“被自信”,出现问题后也很难从自身去寻找原因,试剂厂家背黑锅是大概率事件!检验医学网

    2)敏感性低:除了样本加入量少之外,样本中的干扰物质也是导致敏感性不足和结果不稳定的重要因素。此外,如果试剂研发人员没有采取核酸裂解液和扩增试剂的对抗干扰措施,其检测质量难免会让用户失望。

    3)实验室污染:这种简单的操作步骤并没有避免实验室的污染,也是好多人无法理解的,但吹吸的操作不但携带出少量混合物,更重要的是Tip头有吸附核酸的特性,因此难免发生实验室的污染和核酸丢失。

    3、吸附柱法:目前主要采用胍盐为介质的核酸裂解和乙醇为介质的核酸漂洗,通过这种方法制备的核酸纯度较高,但核酸丢失量大,而且丢弃的残液和吸附柱存有大量核酸,为了消除乙醇对PCR扩增的影响,吸附柱的晾干过程不但费时费力,而且增加气溶胶释放的机会。此外不能进行批量检测和自动化也是缺陷之一。洗脱的核酸残留胍盐和蛋白酶K是难免的,将不同程度影响PCR扩增的稳定性和敏感性。

    4、磁珠法:其原理与“吸附柱法”相同,只不过吸附核酸的载体不是纤维素膜,而是各种大小或修饰的磁珠,磁珠的性能差异是影响试剂盒质量的重要因素,如磁珠大小、悬浮性能、表面修饰成分及磁力大小都会影响磁珠吸附核酸的能力。核酸洗脱过程如果发生磁珠成分被洗掉,那么将严重影响PCR的扩增质量。自动化和高效核酸富集是磁珠法的优势,但实验室污染发生概率要比吸附柱高的多。不同类型的磁珠导致实验室污染的程度也不同,如超悬纳米磁珠要比易沉降的大磁珠更容易发生污染,主要原因是超悬小颗粒磁珠要全部吸附到磁条一侧,所用时间要比大颗粒磁珠时间长,磁珠连同残液一起丢失的情况较难避免,这些丢失的磁珠即变成了实验室污染的元凶。

    二、扩增试剂品质与检测质量

    我们对市场常用的10家“丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒”的扩增试剂进行分析,发现8家扩增试剂盒的抗干扰能力和扩增效率较差,对低核酸含量样本的分辨率低,试剂盒本身容易诱发污染的环节各有不同。PCR扩增试剂的品质与采用什么样的pH值缓冲液、什么样的酶和什么样的添加剂关系密切。我们曾对多家试剂盒的反应液、酶和操作过程进行优化,试剂盒性能都有不同程度的提升,这也许归咎于当时的技术限制,但同时期不同试剂盒质量差异的确存在,只是用户没有机会或条件进行大样本验证。在扩增效率方面,能够做到线性范围样本扩增效率一致的试剂盒很少,这种荧光曲线能够“首尾相接”的扩增性能(上图),恰恰是试剂盒重复性和敏感性的灵魂。

    影响试剂盒品质的环节是多方面的,除了试剂厂家要充分发挥创造智慧,研发出技术含量高而操作要求低的产品外,实验人员也应努力提高自己的专业水平和操作技能,充分了解试剂盒的性能,查找实验失败的真正原因,只有双方共同努力,才能切实提高实验室的检测水平。

 




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