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体外诊断试剂盒检测的PCR扩增技术

发布时间:2019-11-06 阅读:67

    聚合酶链反应(PCR)用于生物科学研究的所有领域, PCR技术的广泛采用彻底改变了生命科学研究。PCR已成为分子生物学应用zui普遍的技术之一,基础技术已经有了许多改进,并发展出许多变型,以适应具体应用,包括逆转录PCR(RT-PCR)、定量实时PCR(qPCR)、逆转录qPCR(RT-qPCR)和数字PCR(dPCR)。PCR是一种强大的技术,但与此同时,它简单易用,成本较低,因此其应用普遍而多样,包括临床、法医和诊断领域。
    PCR扩增技术
    今天,我们将要介绍三种在常规PCR基础上改进并同样应用于体外诊断试剂盒检测的PCR扩增技术。
    首先,我们先复习一下典型的PCR程序,任何种类的PCR都万变不离其宗基于这个原理:
    初始变性:将反应温度升至95°C,孵育反应物2-5分钟(根据酶特性和模板复杂性,zui多10分钟),以确保所有复杂的双链DNA(dsDNA)分子被分割成单链以便扩增。
    循环:
    1. 变性:将反应温度升高至95℃,其将所有dsDNA解链(破坏互补碱基之间的氢键)成单链DNA(ssDNA)。
    2. 退火:将温度降低至低于引物的解链温度(Tm)约5℃(通常为45-60℃),以促进引物与模板的结合。
    3. 延伸:温度升至72℃,这是DNA聚合酶活性的zui佳温度,在这个温度杂交的引物被延伸。
    多重PCR
    相比于传统PCR只使用一对引物,多重PCR则是在同一反应体系内加入两对及以上引物,因此也被称为多重引物PCR。其主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定,如呼吸道病毒、肺炎链球菌的鉴定,脊髓性肌萎缩症的检测等。
    巢式PCR
    巢式PCR使用两对引物,第一对引物扩增与常规PCR无异,而第二对引物则是结合第一次PCR的产物,在其内部再进行第二次扩增,故称为巢式引物。而且,第二次PCR获得的片段长度大大短于第一次产物。巢式设计可以提高扩增的特异性,因为当第一次PCR时产生的非特异性片段将不会与巢式引物结合从而有zui终片段的产生。巢式PCR一般应用于动物方面,如:梅毒螺旋体,HIV,肿瘤基因等。
    扩增组织突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR),又称为等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR),这是一个非常有用的方法来鉴定点突变或基因多态性。ARMS-PCR仍然使用一对引物,但其中一个引物的3’端与目的突变基因配对。如此,3’端与正常DNA模板的失配可显著减少扩增,从而做到选择性扩增突变DNA模版。因为突变设计在3’端引物序列中,若出现错配则不会出现扩增,如此引物仅仅识别突变序列,而不识别正常序列,从而达到检测只知突变基因型的目的。需要注意的是,具有高保真度DNA聚合酶不能用于此种PCR, 因为在此聚合酶作用下,即使引物失配仍然可以产生扩增。临床上,很多肿瘤基因突变检测就是使用ARMS-PCR法来鉴定。
    对于β地中海贫血IVS1-5突变类型,在β珠蛋白中,ARM-PCR引物对正常和点突变等位基因的检验。A段显示与DNA模板中突变(C)匹配的ARMS引物, B段显示突变ARMS引物与正常序列(G)之间的不匹配,C段显示了正常序列(G)以及与之匹配的引物,D段显示正常正常引物和突变(C)之间的不匹配。蓝框显示在引物的zui后五个核苷酸中的一个额外失配以进一步增加它的特异性。
    无论选择什么样的PCR技术或应用,理论上,40轮扩增后会产生240或1012个相同的扩增子。虽然理论PCR应产生连续指数扩增,然而反应zui终会因为非特异性扩增达到平台期。非特异性扩增一般是因为在室温下进行PCR反应时,引物与非特异性模板产生了结合,或者形成引物二聚体。为避免此种情况发生,一种办法则是在反应中使用热启动Taq DNA聚合酶。
    热启动Taq DNA聚合酶
    JumpStartTM Taq DNA聚合酶是一种抗体失活的热启动酶,设计用于zui大限度降低非特异性扩增并同时提高靶标的产量。一旦反应温度达到 70°C,Taq DNA聚合酶活性就会得到恢复,使得PCR具有更高的特异性和产量。这种抗体-酶复合物可实现简单便捷的设置,并相对于手动热启动技术具有更低的污染风险。该酶还可以被加入到预混液制备中,从而实现反应之间更高的一致性。与化学变性的热启动不同,普通Taq DNA酶激活可能需要10分钟,抗体介导的热启动酶则可在60秒内被激活。
    此外,Sigma的JumpStartTMREDTaq®,是高品质 Taq DNA聚合酶与惰性红色染料的独特混合物。该染料能够快速目视确认酶的添加和反应混合。另外,REDTaq反应混合物的PCR产物还可用于自动测序,手册测序和限制性酶切,既不会引起荧光伪影,也不会阻碍测序反应或读取长度或对其他下游应用产生影响。如果需要去除染料,可以使用任何标准纯化方法轻松完成。
    除却JumpStartTM热启动DNA聚合酶之外,我们还提供FastStartTM Taq,KOD XtremeTM和KOD系列的DNA聚合酶,可根据不同特性选择与实际需求选择zui为匹配的DNA聚合酶。
    同样,针对不同特性的mRNA模板,我们还提供不同种类的逆转录酶,如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶、eAMVTM逆转录酶和ThermaStopTM逆转录酶。





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